今天分享一篇年3月发表在《Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology》(IF=6.6；中科院1区)的非肿瘤生信文章，探索一下血管疾病的“单细胞”~
单细胞RNA测序揭示早期小鼠腹主动脉瘤血管细胞的异质性这项研究构建了小鼠腹主动脉瘤动物模型并对动脉瘤血管组织进行了单细胞RNA测序，而后通过生物信息学方法开展了一系列下游分析，识别出8种细胞类型、12个不同群体，揭示了腹主动脉瘤的组织细胞异质性并预测了各细胞亚群的功能，为进一步理解发病机制及将来阐明腹主动脉瘤血管和免疫细胞异质性的实验研究提供了指导。
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01摘要目的：腹主动脉瘤是一种以平滑肌细胞损耗、细胞外基质降解和免疫细胞浸润为特征的危及生命的血管疾病。而控制腹主动脉瘤异质性的细胞和分子特征尚待阐明。
方法和结果：我们对小鼠腹主动脉瘤组织进行了单细胞RNA测序。通过血管周围应用CaCl2诱导C57BL/6J小鼠腹主动脉瘤。无偏聚类识别了8种细胞类型的12个不同群体。比较假手术组和腹主动脉瘤组血管组织中每个细胞群体的百分比和基因表达。此外，我们描述了平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞群体的转录谱和潜在功能特征，并揭示了每种细胞类型的独特调节子。
结论：综上所述，这些数据为小鼠腹主动脉瘤的复杂性和异质性提供了高分辨率的见解，并表明主要细胞类型如平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞中的不同亚群可能对腹主动脉瘤的发病机制有不同的贡献。
02前言背景腹主动脉瘤(AAA)是一种进行性和退行性血管疾病，尚没有经过批准的药物治疗。小鼠模型有助于理解AAA的发病机制。通常认为，免疫细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞，在很大程度上是引发细胞外基质(ECM)过度降解和平滑肌细胞(SMCs)损耗的责任细胞。为了确定实验性动脉瘤早期的全部细胞类型和细胞反应，研究者在C57BL/6J小鼠血管周围应用氯化钙诱导腹主动脉瘤并将氯化钙处理和假手术组的腹主动脉组织制备成单细胞悬液后进行单细胞测序，探索动脉瘤血管组织细胞的异质性、不同功能状态及转录谱差异。03研究方法简述小鼠腹主动脉瘤模型构建C57BL/6J小鼠通过纯合育种维持。用异氟醚吸入麻醉12周龄雄性小鼠后游离肾动脉和髂动脉之间的腹主动脉。腹主动脉瘤小鼠：将一小块浸泡在0.5mol/L氯化钙中的纱布在血管周围应用10分钟，而后换用另一块PBS浸泡过的纱布5分钟。假手术组小鼠：接受0.5mol/L氯化钠处理10分钟，然后用PBS浸泡纱布5分钟。关闭切口，将2%利多卡因局部软膏涂在缝合部位。术前皮下注射0.5毫克/千克的缓释丁丙诺啡。诱导后4天，对小鼠实施安乐死并灌注PBS，收集损伤的主动脉进行scRNA-seq，包埋最佳切割温度化合物(樱花组织切片)并切割成6个微米切片进行免疫荧光染色。样品制备、测序和数据处理收集小鼠肾下腹主动脉并在酶混合物(含有10mg/ml二型胶原酶和1mg/ml弹性蛋白酶的DMEM)中于37℃消化15min。用40微米细胞滤器过滤组织悬浮液，然后g离心5min。细胞用含10%胎牛血清的DMEM重悬。将每组4个主动脉的单细胞悬液汇集在一起作为一个样品。0个细胞/样品装载在ChromiumController(10×Genomics)上。根据制造商指南(10×Genomics)，使用ChromiumSingleCell3’v3ReagentKit构建scRNA-seq文库。cDNA文库是唯一的样品索引和测序池。MiSeq(Illumina)用于NovaSeqS1flowcell(Illumina)上的样品平衡，使用28×91bp测序反应，目标00reads/cell。
使用Seurat(3.2.0版)R(3.6.3版)包进行下游分析。个基因且线粒体基因计数百分比10%的细胞被认为是低质量细胞而被过滤掉。线粒体基因包括mt-Nd1、mt-Nd2、mtCo1、mt-Co2、mt-Atp8、mt-Atp6、mt-Co3、mt-Nd3、mt-Nd4l、mt-Nd4、mt-Nd5、mt-Nd6和mt-Cytb。通过3个阶段对标准化和对数化的数据进行降维:变量基因的选择、PCA、UMAP。然后我们使用莱顿图聚类方法进行细胞聚类。为了识别每个聚类中的标记基因，基于标准化数据进行Wilcoxonrank-sumtest。假手术组和腹主动脉瘤组之间的细胞比例差异用χ2检验进行评估。假手术组和腹主动脉瘤组之间的差异表达基因通过MASTR包分析。基于数据集中的基因总数，使用Bonferroni法进行p值校正。由clusterProfilerR包进行KEGG分析，细胞周期分析由Seurat的CellCycleScoring功能执行，使用SCENIC(single-cellregulatorynetworkinferenceandclustering)进行调节网络分析。04结果简述4.1小鼠腹主动脉瘤中不同细胞群的鉴定
在腹主动脉瘤诱导后4天，使用假手术组和氯化钙处理组的肾下主动脉制备单细胞悬液。VerhoeffVanGieson弹性染色和主动脉横截面上收缩性平滑肌细胞（SMC）标记分子MYH11(SMC特异性肌球蛋白重链)的免疫染色显示，在该时间点有显著的弹性蛋白降解、SMC损耗。在质量控制过滤后，共回收了个细胞，包括来自假手术组的个细胞和来自腹主动脉瘤组的个细胞。无监督聚类识别了12个不同的细胞群体(图1A)。根据已建立的SMCs(Myh11，Acta2)、内皮细胞(Cdh5，Pecam1)、成纤维细胞(Col1a1)、巨噬细胞(Lyz2)、中性粒细胞(Sa8和Sa9)、树突细胞(Klrd1和Flt3)、T自然杀伤细胞(Cd3g，Gzma)和B细胞(Cd79a，Ms4a1)的典型标记基因表达模式，为每个群体指定了假定的生物学身份。与假手术组相比，腹主动脉瘤组包含较低百分比的平滑肌细胞(假手术组vs腹主动脉瘤组:29%vs22.1%)和成纤维细胞(假手术组vs腹主动脉瘤组:41.4%vs36.4%)，但有更多的巨噬细胞(假手术组vs腹主动脉瘤组:21%vs28.5%)、中性粒细胞(假手术组vs腹主动脉瘤组:0.7%vs3.4%)和树突细胞(假手术组vs腹主动脉瘤组:1.7%vs2.8%)。进一步确定了3个不同的巨噬细胞群体(Mφ-1、Mφ-2和Mφ-3)，每个群体都有独特的基因表达谱(图1C和1D)。Mφ-2群体从假手术中占总主动脉细胞的2.6%扩大到腹主动脉瘤中的10.2%(P0.)，而Mφ-1和Mφ-3的相对数量似乎不受动脉瘤诱导的影响。4.2动脉瘤形成过程中的转录改变
差异基因表达分析显示个基因在动脉瘤诱导后的所有细胞类型中表达有变化(
logefoldchange
0.25;adjustedP10e-10)。
在这些动脉瘤反应基因中，Spp1(骨桥蛋白)在腹主动脉瘤组/假手术组上调倍数最大，Cebpb是改变最显著。KEGG富集分析表明，腹主动脉瘤组中破骨细胞分化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、吞噬体、凋亡、白细胞跨内皮迁移和其他炎症相关途径上调；血管平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架的调节、扩张型心肌病和局灶性粘连等途径下调。
4.3主要血管细胞类型的基因表达特征
对每种主要的血管细胞类型的基因表达进行了更详细地分析。巨噬细胞由3个具有不同基因表达模式的群体组成。Mφ-1显示了一种抗炎性巨噬细胞基因谱，其特征是CXCL4(Pf4)和CD(Mrc1)的高表达。Mφ-2显示了典型的炎性巨噬细胞基因图谱，其特征是Il1b和MHCII(H2-Ab1)的强烈富集。Mφ-3的特征是增殖标记物的高表达，如Ki-67(Mki67)。KEGG富集分析显示，与其他2个群体相比，Mφ-1在吞噬作用相关途径中显著富集；Mφ-2在炎症和细胞外基质降解相关途径中富集；Mφ-3在增殖途径中显著富集。差异基因表达分析在巨噬细胞群体中鉴定出21个基因，与假手术相比，这些基因在腹主动脉瘤中的表达发生改变。在这些基因中，Cebpb、Srgn、Aldoa和Gpr35主要由Mφ-2表达。使用标记基因Csf1r和Pf4作为常驻样巨噬细胞的定义，数据显示常驻样巨噬细胞集中在Mφ-1和Mφ-3。平滑肌细胞(SMC)损耗是AAA的另一个病理特征。早在动脉瘤诱导后4天，平滑肌细胞即显著减少(假手术组29%vs腹主动脉瘤22.1%)。本研究发现了两个不同的平滑肌细胞群。SMC-1表达较高水平的收缩蛋白，如SMC特异性肌球蛋白重链(Myh11)和平滑肌α-肌动蛋白(Acta2)。相比之下，SMC-2表达丰富的细胞周期相关基因，提示它们可能为合成型SMC。差异基因表达分析发现，与假手术相比，平滑肌细胞中有11个基因在腹主动脉瘤中的表达发生了改变。成纤维细胞是假手术组和腹主动脉瘤组织中占比最大的细胞群。该细胞群可分为两个主要亚群。溶酶体、细胞外基质受体相互作用以及蛋白质消化和吸收途径在Fibro-1中富集，表明Fibro-1亚群体可能参与细胞外基质的重塑。Fibro-2亚群高表达疾病相关基因和细胞周期基因，表明Fibro-2亚群可能参与炎症和增殖。差异基因表达分析确定了成纤维细胞中的14个基因，与假手术相比，这些基因在腹主动脉瘤中的表达发生了变化。
4.4增殖状态
注意到巨噬细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞群体中的增殖相关基因表达，研究者根据典型标记计算细胞周期相分数，对所有细胞群体进行了细胞周期分析。Mφ-3,SMC-2和Fibro-2细胞群中的大多数细胞处于G2/M期，表达增殖标记物，如Ki-67(Mki67)和细胞周期蛋白依赖激酶1(Cdk1)。与假手术组相比，动脉瘤组织的增殖活性升高(假手术组与腹主动脉瘤组的增殖细胞百分比:10.8%vs15.3%)。为了验证增殖活性，用抗Ki-67和抗巨噬细胞标记物F4/80的抗体进行血管组织免疫染色。与scRNA-seq分析预测的一致，与假组织相比，AAA中Ki-67阳性细胞的百分比增加(假手术组vsAAA：7.20±2.15%vs14.91±3.32%)。假手术组中F4/80阳性细胞百分比为8.06±0.62%，AAA中为13.91±2.59%。4.5基因调控网络
通过SCENIC(single-cellregulatorynetworkinferenceandclustering)映射基因调控网络。为了计算单细胞转录组中每个调控因子的活性，使用SCENICAUCell算法对假手术组和腹主动脉瘤组的各细胞类型进行分析。最终鉴定了85个差异表达的调节因子。在巨噬细胞中，活化的调节因子有Pou2f2(32个靶基因)、Ceppa(20个靶基因)和Lell1(58个靶基因)。10个调控因子在内皮细胞中高度富集(Ebf3、Pparg、Hoxb8、Sox13、Sox17、Sox18、Sox7、Me