微生物主要负责分解饮食中的纤维，它们会生产出重要的营养物质，其中就包括丁酸盐（Butyrate），这是一种能够滋养肠道内细胞的微生物，与代谢疾病的调节有关。然而丁酸盐在动脉粥样硬化中的作用机制尚不清楚。因此，来自中国医学科学院医药生物技术研究所的研究人员们探讨丁酸盐对高脂饮食(HFD)喂养的ApoE?/?小鼠给药后的影响。
发现丁酸通过ABCA1介导的巨噬细胞胆固醇外流改善ApoE?/?小鼠HFD诱导的动脉粥样硬化，这为动脉粥样硬化提供一种治疗策略。
丁酸盐的消耗改变了肠道微生物的组成
为了评估丁酸盐治疗对体内动脉粥样硬化进展的影响，HFD喂养的ApoE?/?小鼠每天通过口服灌胃给予单剂量丁酸盐16周。现有报导已证明肠道微生物群与斑块的进展有关，微生物代谢物丁酸盐改善动脉粥样硬化。在此，为了研究丁酸盐给药对肠道微生物组成的进一步影响，对盲肠内容物进行了基因测序。结果分析表明，丁酸盐给药mg/kg显著增加了肠道微生物的多样性，改变了盲肠微生物的组成。
TMA，另一种公认的肠道微生物代谢物，通过宿主肝脏*素单加氧酶转化为TMAO。最近的研究报道，他汀类药物治疗可通过影响肠道微生物功能，降低患有心血管疾病的成年人的TMAO水平。因此，研究丁酸盐是否影响HFD喂养小鼠的TMA和TMAO合成。用mg/kg丁酸盐和阿托伐他汀处理的小鼠循环TMA水平显著降低。表明丁酸盐可以调节肠道中产生TMA的细菌。然而，在研究中发现，丁酸盐对TMAO的血清浓度没有影响。值得注意的是，所有HFD饮食组的血清TMAO水平均低于饲料喂养的小鼠，这可能反映了雄性ApoE?/?小鼠喂食HFD后肝脏FMO3的下调。
丁酸盐对血脂的影响
为了评估饮食摄入的差异是否有助于丁酸盐治疗的保护作用，对食物消耗和体重进行了监测。HFD组的能量摄入(以kcal表示)比喂饲小鼠多14.3%，但丁酸盐给药不影响HFD喂养的ApoE?/?小鼠的能量摄入。与普通饲料组相比，HFD组的体重在16周后显示出稳定的体重增长，并导致体重增长显着增加（24.2％）。与食物摄入结果一致，与HFD组相比，丁酸盐治疗不抑制HFD诱导的体重增加。治疗12周后，测定小鼠血清生化参数。与对照组相比，HFD饮食确实导致血清TC、LDL-C、非HDL-C、HDL-C和葡萄糖水平显著增加。而丁酸盐显著降低了HFD引起的TC升高，对血清HDL-C、葡萄糖、TG和总胆汁酸水平无明显影响。在此，阿托伐他汀降低LDL-C（?16.5%)和总胆汁酸(?42.8%），但葡萄糖和TG显著升高。总之，数据表明丁酸盐可以预防HFD诱导的ApoE?/?小鼠血脂异常。
丁酸盐消耗减少动脉粥样硬化
为了进一步阐明丁酸盐对动脉粥样硬化的保护作用，对主动脉的enface分析和主动脉窦面积的横断面分析进行了评价。HFD组动脉粥样硬化病变面积明显增加，两种剂量的丁酸盐均能显著减少动脉粥样硬化病变的形成。阿托伐他汀组总病变面积下降到与丁酸组mg/kg相似的水平。虽然主动脉窦斑块体积经常被用来评估动脉粥样硬化的轻度或早期阶段，但为了更好地了解丁酸盐对肝脏脂肪变性的影响，对HFD和HFD的小鼠加mg/kg丁酸盐进行肝脏转录组分析。丁酸盐治疗后，横断面病变面积适度减少，表明主动脉根部脂质沉积和泡沫细胞形成的趋势下降。此外丁酸盐减少巨噬细胞向动脉粥样硬化斑块浸润，表明丁酸盐抑制ApoE?/?小鼠动脉粥样硬化病变的炎症含量。然后，研究者评估了动脉粥样硬化的发展与脂质水平变化之间的关系。线性回归分析表明，主动脉病变面积与非HDL-C、TC和LDL-C呈正相关，这些数据进一步支持丁酸盐改变血脂有助于抑制动脉粥样硬化病变的发展。
丁酸盐抑制HFD诱导的肝脏脂肪变性。
其次，为了研究丁酸盐对肝脏脂质代谢的影响，评估了所有实验组肝脏脂肪变性的程度。HFD组肝脏中形成了显著的脂质积累，其特征是肝脏切片中存在大量的微囊和大囊泡脂肪变性。然而，丁酸盐处理组中脂质滴很小并且含量减少。与肝脏中观察到的局灶性脂肪变化一致，油红O分析证实丁酸盐能显著预防HFD引起的肝脂肪变性。以上结果表明，丁酸盐对脂肪肝有有益的代谢作用。据报道，肝脂肪变性与颈动脉粥样硬化斑块独立相关，非酒精性脂肪肝是CVD的独立危险因素。因此，对肝脏脂肪变性的有益作用可能会减轻动脉粥样硬化的进展。
丁酸盐改变肝脏转录组
为了更好地了解丁酸盐对肝脏脂肪变性的影响，对HFD和HFD的小鼠加mg/kg丁酸盐进行肝脏转录组分析。在丁酸盐处理下，88个基因被鉴定为差异表达，其中62.5%被下调。27个差异表达基因（占总数的31%）与脂质和/或葡萄糖代谢有关。与HFD对照相比，主要参与脂质代谢的22个丁酸调控基因中有15个被下调。有明显的降脂基因，如Acot1，Acot2，Plin2和Plin5。丁酸盐处理小鼠的脂肪酸降解相关基因也下调，包括Cyp4a10、Cyp4a14和Cyp4a31。同时，负责葡萄糖稳态的SLC2A4(也称为葡萄糖转运体4型，Glut4)和GCK（葡萄糖激酶）基因的表达增加。肝脏基因表达的变化表明丁酸盐不仅改变脂质代谢，而且影响葡萄糖稳态。因此，进行差异表达基因与动脉粥样硬化表型（包括血脂水平）的相关性分析。观察到肝脏脂肪变性与Srebf1（甾醇调节元件结合因子1）和Pklr(丙酮酸激酶L/R)基因的表达呈负相关，而与Vnn1(Vanin-1)表达正相关。
胆固醇7-α-单加氧酶(又称细胞色素PA1，CYP7A1)是胆汁酸生物合成的关键限速酶，负责最终消除肝脏胆固醇。丁酸盐治疗导致Cyp7a1的上调，如肝脏转录组数据所示。研究者进一步发现主动脉病变区域和Cyp7a1之间以及肝脂肪变性和Cyp7a1之间存在显着的负相关性，这表明丁酸盐的治疗效果与胆固醇分解代谢的调节以及RCT通路之间可能存在联系。因此，重点研究丁酸盐是否增强了RCT过程，并分析了几个RCT相关肝基因的表达。ABCA1是一种质膜转运蛋白，可介导游离胆固醇和磷脂向贫脂载脂蛋白A-I（ApoA-I）的流出，并且对于HDL颗粒生物发生至关重要，这可以启动RCT中的早期步骤。LDLR和HDL受体SR-BI在清除血液中的脂蛋白方面起着至关重要的作用。结果表明，丁酸盐处理可显著提高小鼠肝脏ABCA1水平，而不影响LDLR或SR-BI水平。
丁酸盐通过Sp1介导的途径诱导外周巨噬细胞ABCA1的激活
胆固醇从外周巨噬细胞流出，积累过量的胆固醇是RCT的重要步骤。然后研究者评估了ABCA1在小鼠主动脉粥样硬化病变中的表达。与HFD喂养的小鼠相比，丁酸盐处理组ABCA1染色面积与主动脉根部斑块面积的百分比显著增加。此外，与载体对照相比，丁酸盐孵育的腹腔巨噬细胞ABCA1蛋白水平明显升高。接下来，进行脂质外排实验，以确定丁酸盐对ABCA1介导的巨噬细胞胆固醇外排的影响。丁酸盐以剂量依赖性方式增加RAW.7巨噬细胞胆固醇外流，此外，丁酸盐处理下ABCA1的蛋白水平显著升高，而SR-BI或ABCG1的蛋白水平则无明显变化。胆固醇从巨噬细胞流出到HDL需要SR-BI和/或ABCG1，目前的结果表明丁酸盐增加的巨噬细胞胆固醇流出是ABCA1依赖的。
然后研究ABCA1mRNA转录水平和启动子活性，阐明丁酸盐对ABCA1表达的分子机制结果表明，丁酸盐可引起ABCA1启动子的mRNA水平和荧光素酶活性的浓度依赖性上调。已知Sp1和肝X受体(LXR)α在ABCA1的转录诱导中起着重要作用，在这里，研究者观察到丁酸盐降低了RAW.7细胞的Sp1水平，但不影响LXRα水平。然后，研究了Sp1是否参与丁酸盐诱导的ABCA1表达。为了证实Sp1的减少是否会增加ABCA1的表达，进行了siRNA转染试验。发现转染24小时的siSP1增强了丁酸盐在ABCA1表达上的诱导，而ABCA1的基础水平没有受到影响。此后，使用MithramycinA，一种GC特异性DNA结合抗生素，阻断Sp1的结合。结果清楚地表明，单用MithramycinA不能抑制Sp1水平，但完全废除了丁酸盐介导的RAW.7细胞ABCA1的诱导。这些发现表明丁酸盐可能通过降低Sp1水平来增加ABCA1的表达，但需要Sp1与其靶DNA的相互作用。
丁酸盐的口服灌胃改变了微生物组成，增强了因HFD而降低的肠道微生物多样性。可显著抑制HFD诱导的动脉粥样硬化以及肝脏脂肪变性，而不改变APOE?/?小鼠的体重增加。并通过调节脂质/葡萄糖代谢的基因表达对肝脏有代谢作用。此外，丁酸在体内外显着诱导ABCA1，并且Sp1途径被认为是潜在的机制。
总之，研究表明丁酸在其动脉粥样硬化保护中起着多方面的作用，其中至少有一个重要的部分是通过改进RCT调节脂质代谢介导的，为丁酸盐对脂质稳态和动脉粥样硬化代谢作用提供新见解。
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